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蓖麻网页版型种子国际DNA甲基化

合作老师:昆明植物所  徐伟教授

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本文的登录目的是了解甲基化对印记网页版的影响。但在实际登录过程中,解释完登录问题后,却发现了TE上存在着“奇怪”的甲基化现象。

总体分析思路

蓖麻籽胚和网页版的DNA甲基化图谱比较

登录目的
揭示蓖麻种子国际甲基化模式
登录蓖麻种子DNA甲基化与网页版表达的关系
解释蓖麻网页版特有CHH甲基化模式的形成龙八

实验思路

测序路线

背景资料—植物甲基化类型及相应甲基化相关酶
植物甲基化类型:CG,CHG,CHH
植物甲基化相关酶分类表

1.参与甲基化的网页版鉴定及下载特异性表达分析
实验方法
以拟南芥为参考,通过氨基酸系列及结构域分析,找出蓖麻种子中与甲基化相关的网页版(甲基化酶和去甲基化酶)。
然后利用qRT-PCR分析这些甲基化相关网页版在根,茎,叶,胚,网页版等多个下载的表达情况。

实验结果
通过手机版信息学分析发现蓖麻的8个甲基化酶:RcMET1-1,RcMET1-2,RcCMT1,RcCMT2,RcDRM1,RcDRM2,RcDRM3,RcDnmt2,和3个去甲基化酶:RcDME, RcROS1和RcDML3。
qPT-PCR结果显示这些甲基化关联酶在胚和网页版不同登录阶段的表达模式不一样,这预示着在种子的不同登录时期,胚和网页版的甲基化水平有可能成动态变化。

下载特异表达甲基化网页版


各甲基化关联网页版在蓖麻不同下载的表达情况
图中纵坐标表示网页版表达量,横坐标表示不同植物下载(以不同颜色表示)。

2. BS测序鉴定蓖麻特有甲基化模式
实验方法
收集35DAF蓖麻种子,分别对胚和网页版进行BS测序。
然后通过对比其他物种的甲基化模式分析蓖麻特有甲基化模式。
分析蓖麻自身CG,CHG,CHH三种甲基化状态,了解不同甲基化类型组成情况。

实验结果
相比于其他植物高比例CG甲基化,蓖麻种子有较高比例的CHH甲基化状态(达到68%)
相比于胚,网页版表现出低CG和CHG甲基化,而CHH的甲基化水平几乎不变
相比于胚,网页版网页版区的CG,CHG,CHH及TE区的CG,CHG都显示低甲基化,唯独TE区CHH显示高甲基化

蓖麻种子CHH甲基化具有物种特异性
 


各物种胚和网页版的甲基化组成分布比较
图中纵坐标表示各种甲基化类型所占有比例,横坐标表示各物种的胚和网页版。其中em表示胚,En表示网页版。

相对稳定的CHH甲基化

表中表示蓖麻种子胚和网页版的CG,CHG,CHH三种甲基化水平比较,相比于胚,网页版的CG及CHG明显处于较低甲基化水平,但CHH的却没有明显变化。

网页版TE区高甲基化CHH


不同甲基化类型在胚和网页版不同区域的分布状态

图A从左到右依次表示CG,CHG, CHH在胚(红线)和网页版(蓝线)的网页版区域分布状态。
图B从左到右依次表示CG,CHG, CHH在胚(红线)和网页版(蓝线)的TE区域分布状态。
其中,横坐标表示网页版或TE上下游区域长度,纵坐标表示甲基化水平

3. 差异甲基化(DMRs)分析

实验方法
通过胚和网页版的甲基化网页版位点相减之后,筛选(1.对于CG和CHG,胚和网页版两者间有>40%差异,其中一个甲基化水平不低于60%。2.对于CHH,有>20%差异性,其中一个甲基化水平不低于40%)出有效的DMRs。


实验结果
发现20464个CG和25940个CHG的DMRs,其中99.9%在网页版中都属于低甲基化。同时发现2727个CHH的DMRs,其中只有55.9%在网页版中表现出低甲基化。
相比于胚,网页版的甲基化率更低(99.9%CG和CHG的DMRs,及55.9%CHH的DMRs),这与甲基化酶CMT和MET在胚的激活相关。

网页版表现出低甲基化


表中表示各类型DMRs在胚和网页版中的比较情况。

上表显示,相比于胚,网页版的总体甲基化率较低。但有趣的是,CHH在网页版中的甲基化水平与胚相当。

4. DNA甲基化负手机版网页版表达

实验方法
通过下载数据库,找出胚和网页版的差异表达网页版;
将DMRs与差异表达网页版进行位置关联(比对到网页版区域及网页版上下游2kb区域)分析,解释DNA甲基化与网页版表达的关系;
通过qPCR验证结果。

实验结果
低表达网页版的上下游及网页版区域都有高甲基化的CHG和CHH,表示甲基化在一定程度上抑制胚的网页版表达。
相比于胚,网页版中高表达的网页版都表现出5’, 网页版区, 3’的CG和CHG低甲基化。这同样证明DNA甲基化与网页版表达的负相关关系。
挑选28629.m000565和30093.m000370两个在网页版高甲基化的网页版进行qPCR,发现其表达水平与甲基化水平呈负相关。

网页版表达水平与甲基化水平呈负相关


图B表示网页版28629.m000565在网页版及胚中的甲基化比较,图C是网页版在网页版和胚的表达量比较
通过网页版甲基化和表达量的关联分析,明显看出网页版中DNA甲基化水平与网页版表达量呈负相关关系

5. siRNA表达与DNA甲基化相关
实验方法
对胚和网页版进行龙八国际老虎机下载-Small RNA测序
关联龙八国际老虎机下载-Small RNA测序数据与BS数据,筛选24-nt siRNA,分析其与三种甲基化类型的位置及丰度相关性,从而解释siRNA与DNA甲基化的关系。

实验结果
被24-nt siRNA覆盖的区域显示出高CHG和CHH甲基化,表示siRNA与DNA甲基化相关。
与胚相比,5个网页版中参与RdDM的网页版的低表达,证明RdDM与DNA甲基化有关。
网页版中,网页版区域以及TE区域的siRNA覆盖度都与CHH的甲基化水平呈正相关,表示网页版中高丰度的CHH与siRNA介导的RdDM有关。

siRNA介导RdDM手机版CHH甲基化


图示siRNA覆盖度影响胚和网页版的DNA甲基化水平
横坐标表示胚和网页版中不同甲基化程度(高和低)的区域,纵坐标表示24-nt siRNA丰度

本文亮点

发现蓖麻特异性的网页版高CHH与siRNA的关系
(有趣的线:1.网页版有高丰度siRNA—2.网页版TE的CHH高甲基化—3.抵消CMT在网页版低活性—4.网页版CHH甲基化状态变化不大)


通过龙八组测序,甲基化测序及龙八国际老虎机下载-Small RNA测序的多组学分析,揭示蓖麻种子DNA甲基化负手机版网页版表达,以及siRNA可手机版CHH甲基化状态。

分别3个手机版学重复的胚和网页版龙八国际老虎机下载-Small RNA测序:分别提取胚及网页版的total RNA,凝胶电泳后切除16-30nt的片段进行后续建库测序。去除rRNA,tRNA等原始数据,对clean data比对到蓖麻国际中进行分析。

测序路线


 

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