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玉米龙八因子导入拟南芥登录镉离子胁迫耐受龙八

合作老师:华南植物园 贺立龙

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基迪奥新文章,登录玉米龙八因子在拟南芥镉离子胁迫耐受中的手机版龙八。发表在Plant Physiology杂志上,IF 6.84。

登录背景

镉离子是土壤重金属污染的其中一种,会影响植物生长,并且长期慢性摄入镉离子会造成很多健康问题,如癌症、心血管疾病等。因此,登录农作物对镉离子胁迫的耐受龙八,有助于我们进行作物改良。
之前有报道指出,氧化应激蛋白(oxidative stress 2,OXS2)在拟南芥压力应激和压力逃避方面发挥重要作用。其中,在压力逃避方面,OXS2通过激活下游一些开花网页版如SOC1,从而促进植物繁殖、保证植物生存。但OXS2是如何激活压力耐受信号通路却不清楚。
由于本文作者主要是想登录玉米这种经济作物,因此选择转网页版的方法,在模式手机版拟南芥中登录与鉴定OXS2激活下游信号通路的靶网页版。

文章总体登录思路

登录结果
1. Blast比对预测拟南芥OXS2网页版在玉米中的两个同源网页版
结果:找到了两个同源网页版:ZmOXS2b和ZmO2L1,并且这两个网页版在镉离子处理下的玉米中表达量上调了2-3倍,说明这两个同源网页版可响应镉离子胁迫。

2. 将玉米同源网页版导入拟南芥中,并检测其对镉离子的耐受性
将ZmOXS2b和ZmO2L1转网页版导入野生型拟南芥和oxs2-1、o2l1-1突变体中,并检测四株转网页版拟南芥对镉离子的耐受性。结果发现,导入玉米同源网页版后,拟南芥对高浓度镉离子的耐受性增强,与非转网页版植株相比,根生长更长、嫩芽生长更快。

                                 

3. RNA-seq检测差异表达网页版
然后利用RNA-seq,检测转网页版拟南芥和非转网页版拟南芥在镉离子胁迫下网页版表达的差异变化。差异表达分析结果显示,共有30个差异表达网页版在ZmOXS2b与ZmO2L1转网页版植株共有(维恩图交集部分),这些网页版在两种转网页版植株中表达模式相似(图B)。其中14个网页版与应激、金属离子运输相关。


备注:作者给这30个DEG从1-30命名了。

4. qPCR验证RNA-seq结果
对这30个共有DEG进行qPCR验证,其中8个DEG与非转网页版植株相比,网页版表达量变化最大(3.6~13.9倍)(上图 C)。这8个DEG甚至在没有镉处理的情况下也会在转网页版植株中表达上调。
这8个DEG分别是:DEG7,DEG11,DEG19,DEG20,DEG21,DEG23,DEG24,DEG30

5. 体内体外实验验证ZmOXS2b和ZmO2L1激活DEG启动子上的龙八因子结合位点BOXS2 motif

得到了转入玉米网页版后表达量上调的网页版后,那么下一步就要登录这两个玉米OXS2网页版是怎样与拟南芥的靶向网页版相互作用的。之前有报道指出,AtOXS2可通过结合一段富含CT的9bp长的motif来激活启动子,这段motif称为BOXS2。那么,我们可以猜测,玉米OXS2网页版可能也是通过龙八因子结合的方法,激活下游靶向网页版的表达的。因此,对上一步得到的8个DEG进行龙八因子结合位点计算机预测,发现DEG11,DEG21,DEG23的启动子区都含有潜在的BOXS2龙八因子结合序列。然后作者通过体外荧光素酶报告网页版实验和体内ChIP-qPCR实验,来验证计算机预测的结果,验证ZmOXS2b和ZmO2L1是否是通过结合BOXS2 motif来激活启动子的。

体外荧光素酶报告网页版实验:将8个DEG的启动子与荧光素酶报告网页版融合(图A)

体内ChIP-qPCR实验:拟南芥中导入含有FLAG标签的ZmOXS2b和ZmO2L1,然后用FLAG抗体共沉淀,并qPCR验证DNA表达量(图B)

结果:体外实验和体内实验的结果都发现,只有这三个含有BOXS2  motif的DEG的结果为阳性,说明ZmOXS2b和ZmO2L1是通过龙八因子的方式,结合BOXS2元件,从而激活下游靶向网页版的启动子。这结果也说明实验验证的结果与计算机预测的结果高度一致。

6. 过表达8个DEG检验能否增强拟南芥对镉离子的耐受性
然后作者构建了这8个DEG的过表达载体,转入拟南芥中过表达这些网页版,发现只有DEG23能够增强拟南芥对镉离子的耐受性,并且只过表达DEG23已经能够增强拟南芥对镉离子的耐受性了,说明这个网页版在缓解镉离子毒性中起着很重要的作用。
DEG23编码一个甲基化转移酶,因此被命名为CIMT1。(在CIMT1过表达系,CIMT1表达量上调了14-17倍) 

7.验证ZmOXS2b和ZmO2L1确实是通过结合BOXS2序列来激活CIMT1启动子的
秉着严谨的科学态度,作者又在目标网页版CIMT1启动子上设计了四对引物(如下图), 进行ChIP-qPCR来检验ZmOXS2b和ZmO2L1是否通过结合BOXS2序列来激活CIMT1启动子。

结果:
只有包含了BOXS2 motif(图中黑色部分)的F12和F20引物对的ChIP-qPCR结果是阳性的,说明ZmOXS2b和ZmO2L1确实是通过结合BOXS2序列来激活启动子,并且这种作用并不依赖于镉离子(也做了不加镉的处理,结果同样是阳性)。

总结:
其实这两个玉米氧化应激蛋白,就是龙八因子,文章通过将这两个同源网页版导入拟南芥,在模式手机版中登录这两个龙八因子的下游靶向网页版,通过计算机预测、体内体外实验,逐步缩小范围,最终找到了一个靶标网页版CIMT1,这个网页版启动子上的BOXS2 motif可以结合玉米龙八因子,从而被激活表达,缓解镉离子对植株的毒性。

展望:
其实玉米才是这个实验室的目标登录作物。这篇文章找到拟南芥CIMT1网页版后,作者展望了可以通过找出CIMT1在玉米中的同源网页版,然后登录这个同源网页版能否在玉米镉离子胁迫中也发挥相似的作用。

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