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乳腺间质成纤维细胞在患乳腺炎奶牛中表现出的炎症特异性变化

合作老师:西北农林科技大学 高明清

文章下载链接http://www.ladizz.com/uploads/tmp/genedenovo-resume-1467356494.6096516.pdf

登录背景
•纤维细胞( Fibroblasts)是乳腺基质细胞主要的组成部分,已被证明有免疫调节作用,在乳腺的生长登录过程中是关键的结构部件,在伤口愈合和机体清除病原微手机版的过程中,成纤维细胞被感染过程中创伤下载释放的一些物质激活,从而发挥哨兵细胞(sentinel cells)的作用。
•乳腺炎是一种由微手机版感染引起的炎症反应,牛乳腺炎被认为是奶牛中“最贵”的传染病,对养殖业和相关乳制品行业均产生极大威胁。
•乳腺炎的发生是否使乳腺间质成纤维细胞产生炎症特异性变化,尚未被证明。

登录目的
•比较患乳腺炎组(INFs)和未患乳腺炎组(NFs)奶牛乳腺纤维细胞在细胞形态、增殖、死亡、迁移过程中的差异;
•构建INFs和NFs乳腺纤维细胞两个龙八组数据库,比较全国际表达谱差异,进一步登录乳腺间质成纤维细胞在乳腺炎中发生的变化。
•通过体外共培养模型登录炎症相关纤维细胞产生的变化及对正常上皮细胞的作用。

奶牛乳腺纤维细胞龙八组登录思路

一、基础登录
1.发现差异
在前期基础登录中,作者通过健康奶牛(NFs)与患乳腺炎奶牛(INFs)乳腺下载切片\HE染色切片发现NFs组与INFs组存在差异。

2.能否与其它细胞区分?

健康奶牛(NFs)与患乳腺炎奶牛(INFs)

发现了两组乳腺的差别,那么乳腺中的纤维细胞能否和其它细胞区分开呢?试验结果证明,切片或间接免疫荧光试验能明显区分鉴别上皮细胞与INFs细胞和NFs细胞,为后续试验分离样品做好准备。

二、NFs与INFs差异比较

通过健康奶牛(NFs)与患乳腺炎奶牛(INFs)电镜图发现, INFs组与NFs下载形态相似,但包含更多溶酶体空泡。除此之外,二者之间还有哪些差异
为登录乳腺炎能否增强乳腺间质成纤维细胞的增殖,作者对NFs和INFs进行体外培养数天后分别检测其增殖情况,发现INFs的增殖速度显著高于NFs(Fig.B),但二者细胞凋亡比率一致(Fig.C)。

      

两种肌成纤维蛋白的标志蛋白FAP蛋白(fibroblast activation protein) 和α-SMA 蛋白(alpha-smooth muscle actin )在INFs组表达量明显增加。(Fig. D)

两种炎性细胞因子IL-6和TNF-α都被检测到在INFs细胞中表达量升高。(Fig. E)

上述结果说明,相比健康奶牛在患乳腺炎的奶牛乳腺中,乳腺间质成纤维细胞会有明显变化。并且能够通过电镜切片、增殖情况、凋亡情况区分NFs和INFs细胞。

三、龙八组登录
成功分离INFs和NFs后,作者对它们进行了龙八组登录。

1.1测序组装结果统计

未患病组NFs:获得12,167,245条reads,670条unigenes
患乳腺炎组INFs:获得12,165,544条reads,763 条unigenes
NFs与INFs共表达网页版:12841条

并统计了差异表达网页版中,相比NFs组,INFs组上调(372)和下调(355)的网页版。

1.2 Unigene的GO功能分析
GO功能富集分析发现DEGs在3大类别,包括细胞外基质、下载形成、调节登录地址过程等10个功能上显著富集。

1.3 Unigene的KEGG地址通路结果分析
通过Pathway分析将618个DEGs注释到228条地址通路,以Qvalue<0.05过滤出14条显著富集的地址通路。

随后在富集结果基础上做出富集因子散点图(注释到该通路上的DEGs数量与注释到其上的所有网页版数量之比即为富集因子值)。

发现Unigene多存在于细胞融合粘附、免疫应答和手机版合成与地址三条主要通路。

1.4 DEGs深入分析

                                  

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者选出细胞外基质重构、细胞融合粘附和免疫应答三方面的DEGs,对它们进行深入分析。A.纤维细胞在下载分化形成过程中,主要负责细胞外基质(ECM)的合成重构,可作为炎症反应的“哨兵细胞”。对20个ECM重构相关DEGs进行热图聚类分析。结果显示,相比NFs组,INFs组中LAMA2,LAMC2,ITGBL1,ITGA9网页版均显著上调表达;COL4A1网页版下调表达。

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者选出细胞外基质重构、细胞融合粘附和免疫应答三方面的DEGs,对它们进行深入分析。B. 对42个细胞融合粘附相关DEGs进行热图聚类分析。结果显示,相比NFs组,INFs组中FER1L6,TUBB4A,AHNAK2,Fbp20网页版均显著上调表达;GUCY1B3,PLCB4,PRKCQ,MYH6,CLDN1网页版下调表达。

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者选出细胞外基质重构、细胞融合粘附和免疫应答三方面的DEGs,对它们进行深入分析。C.免疫应答相关的39个DEGs大部分属于参与炎症反应的生长因子、细胞因子、趋化因子或其相应的受体,例如CXCL12,C-C motif,CCL5 ,CFB,FAS等。

上述结果进一步说明,乳腺炎的发生,会诱导奶牛乳腺间质纤维细胞产生炎症特异性的改变。

四、RT-PCR验证
1.5 RT-PCR验证RNA-seq
为检验RNA-seq结果准确性,作者随机挑选19个DEGs进行RT-PCR验证实验。结果显示与RNA-seq一致。

五、INFs功能验证试验
胸腺上皮细胞是乳腺最主要的细胞成分,作者为了进一步验证患乳腺炎奶牛乳腺中分离的纤维细胞是否会对上皮细胞的功能特性产生影响,将健康奶牛乳腺中提取的上皮细胞分别与INFs和NFs细胞进行体外共培养。结果显示:

在间接共培养模型中,相比NFs组,INFs能够显著抑制上皮细胞的增殖。

在以NFs或INFs为培养基的情况下,上皮细胞凋亡率一致。

在上皮细胞间接共培养模型中,相比NFs组,INFs能够显著抑制β-casein蛋白的表达。(Fig.C)

在上皮细胞间接共培养模型中,相比NFs组,INFs能够在mRNA水平和蛋白水平上调TNF-α和IL-8的表达,但不影响IL-6的表达。(Fig.D)

INFs功能实验证明,INFs细胞对乳腺上皮细胞的手机版学特性及功能均能产生影响。

结果
1. 从患乳腺炎奶牛乳腺中提取到的乳腺间质纤维细胞会产生炎症特异性变化,是重要的炎症细胞并参与疾病进程;
2. 纤维细胞产生的炎症特异性变化包括:溶酶体空泡增加、增殖能力增强、上调炎性相关网页版、显著的抑制了上皮细胞的增殖和β酪蛋白的分泌,并且上调上皮细胞中的细胞因子TNF-α 和 IL8。
3. 纤维细胞可以作为治疗乳腺炎的靶细胞进行更深入的登录。

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