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重测序、龙八组和甲基化贯穿分析
                                ——国际印记登录

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目的:
分析杂交种子(F1)网页版表达谱的亲源效应(母源表达或父源表达);
分析杂交种子(F1)网页版和胚的甲基化差异以及甲基化的亲源效应;
分析亲源表达效应与甲基化的关系

登录概述和样本设计

登录概述:
将蓖麻两个品系(ZB107,ZB306)进行龙八组测序,比较品系间SNP。分别对两品系正反杂交种子网页版的F1(ZB306×ZB107)与F’1(ZB107×ZB306)进行测序,找出亲源特有的位点与网页版,并进行了表达量分析与甲基化分析。
样本设计:

总体分析思路

1.网页版印迹位点

登录方法:
对四个样本进行龙八组重测序,将两个亲本进行比较,得到SNP信息。将正交与反交样本同样比较得到SNP信息,根据网页版等位网页版表达量的母本/父本的2倍关系,得到亲源特异的SNP,并进行了筛选。

所得结果:
杂合子中184个母系偏向表达SNP(178个网页版),11个父系偏向表达SNP(9个网页版),这些作为潜在的印迹区域。30个位于网页版间区,22个为5’与3’UTR延伸,8个为新龙八本(可能是lncRNA)。
61 (ZB107)与10 (ZB306)网页版有大于90%的亲本偏向性。

区分不同亲源reads的原理

亲本特异表达网页版分析

1)F1与F’1中网页版在母本和父本来源网页版的表达情况统计图。
2)图中各点代表得到潜在印迹网页版,红色代表亲本特异表达的网页版,蓝色代表非特异表达网页版;红线与蓝线分别代表2:1与1:1的父/母本表达量比值的对数。

2.印迹位点的确认

登录方法:
将所有的母系偏向的经过筛选(偏向率超过95%,reads数超过100条)的网页版,以及所有的父系偏向的网页版找出,并进行了qPCR分析。

所得结果:
1)共57个印迹网页版:51(全部58)个网页版在母系等位网页版中显著表达,6(全部9)个网页版在父系等位网页版中显著表达。这些网页版的表达量均由qPCR结果进行了验证,结果与测序得到的一致。
经过确认,印记网页版中大部分能在登录过程中保持最初表达模式,且超过一半不是网页版特异表达。

3.印迹网页版的分类

登录方法:
将得到的印迹网页版进行cluster分析,以及功能分析,并进行了在各物种(拟南芥、水稻、玉米)的同源性比对。对印迹网页版附近的转座子信息进行了分析。(证据显示:网页版国际中低甲基化区域与转座子有关。)

所得结果:
1)大部分印迹网页版都没有聚类分布在国际上,(除去三个位置上有2到3个网页版相近),GO分析结果没有显著性富集的分类。
2)印迹网页版在植物中同源性较差,仅有8个(拟南芥/蓖麻),5个(水稻/蓖麻),12个(玉米/蓖麻)印迹网页版在所示物种中有同源网页版。其中,仅有一个网页版K domain gene 29765.m000727 (homologous to AT3G08620) 在四个物种中均有同源网页版(RNA结合蛋白网页版)。
3)转座子结果显示:在印迹网页版附近有大量转座子富集,明显与拟南芥的DNA/MuDR以及玉米中的DNA/MuDR不同。

转座子分类图

全部杂合后代中,印迹网页版与非印迹网页版附近区域的转座子的分类比较。

4.网页版甲基化分析

登录方法:
对网页版及胚样本进行了甲基化测序(BS、30×),比较了胚与网页版在网页版区5’与3’端向外延伸2kb的区域及网页版区的甲基化情况。2)对35DAF网页版中亲本特异性甲基化率进行了分析。

所得结果:
1)印迹网页版在网页版中相对胚甲基化率较低,20个印迹网页版在网页版中特异低甲基化。在母源与父源表达比较方面,网页版的印迹性与DNA甲基化相关(P<6.6e-6)。在胚与网页版比较方面,除去两个网页版优先表达网页版外,印记网页版的表达量与甲基化相关性不大。
2)找出了6个亲本特异性甲基化的印迹网页版,均为母本中低甲基化而在父本中高甲基化,大部分印迹网页版没有出现亲本特异性甲基化,说明甲基化可能只是网页版印迹现象的部分原因。

网页版与胚中网页版及转座子甲基化率比较

35 DAF hybrid of ZB107×ZB306,胚(红色)与网页版(蓝色)的各位置CG甲基化率水平(200bp为一个window),图中两段分别表示网页版与转座子前2kb与网页版后2kb,虚线代表网页版与转座子的起止。

亮点
1)通过登录鉴别了蓖麻中大量的新印迹网页版,通过系统分析植物印迹网页版在进化过程的保守性发现了植物印迹网页版具有很强的物种特异性。通过国际的甲基化分析,发现了网页版印迹的发生和DNA甲基化密切相关,说明DNA甲基化很可能是印迹网页版发生的主要驱动力之一;
2)利用父母本差异SNP,实现对子代父源、母源等位网页版表达和甲基化差异的分析;
3)对重测序、RNA-Seq与甲基化分析三者间进行了贯穿,一起解释网页版印迹现象。

 

 

 

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